近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得了显著的进展。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在攻克血液恶性肿瘤方面取得了成功，而基于AAV载体的基因疗法为罕见病患者提供了新的治疗选择。与此同时，CRISPR基因编辑技术的迅速发展更是为基因治疗揭开了新篇章，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，体内基因编辑疗法也展现了良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题引发了广泛关注，因为其对基因组DNA的直接作用意味着任何不准确的修改都可能造成潜在的长期风险。

为此，美国食品药品监督管理局（FDA）等监管机构对基因治疗的安全性提出了指导原则，主要集中在两个方面：一是评估基因组的完整性，包括染色体重排、大片段插入或缺失、外源DNA整合及其潜在的致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括类型、频率和位置。本文将详细介绍各种脱靶检测技术，帮助科研人员在基因编辑过程中降低脱靶风险。

脱靶效应检测技术

脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外，可能错误地作用于与目标序列相似的非目标位点，导致意外的基因组改变。为保障基因编辑的安全性和有效性，已经开发了多种检测和评估脱靶效应的方法。这些检测方法根据实验条件可以分为体内检测和体外检测两类。

体内检测方法

体内检测方法指的是在活细胞或生物体内进行的脱靶效应评估，这些方法通常能够更接近真实的生物学环境。

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。其基本原理是通过向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物可以插入到Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点中。随后，利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面发现潜在的脱靶编辑位置。GUIDE-Seq因其高效性和准确性迅速成为评估基因编辑特异性的标准方法之一。

• 优点：提供全基因组水平的脱靶位点信息；直接检测体内真实的双链断裂事件；能够检测到低频的脱靶事件。
• 缺点：实验操作较为复杂，要求较高技术水平；可能错过那些不易插入的脱靶位点。

体外检测方法

体外检测方法则是在实验室条件下，使用从生物体提取的成分或者合成材料进行测试，这些方法能提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq是一种全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法。其通过在体外使用纯化的基因组DNA，模拟Cas9核酸酶的切割作用，然后对消化后的DNA进行全基因组测序，以识别和量化由于Cas9造成的双链断裂位点，实现潜在的脱靶编辑位置检测。

• 优点：无偏见地鉴定全基因组的脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性；操作相对简便。
• 缺点：可能遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要昂贵的设备及复杂的数据分析。

综合应用

在基因治疗的临床应用中，评估CRISPR的脱靶风险显得尤为重要。结合多种检测方法进行全面评估，有助于降低潜在的脱靶影响。随着技术不断进步，未来有望出现更多高效、准确的脱靶检测手段，进一步提升基因编辑技术的安全性和可靠性。

PG电子在基因编辑领域的持续创新和技术发展，将为科学研究和临床应用提供更高效的解决方案，帮助实现更安全的基因治疗。我们的平台覆盖靶点设计、靶点筛选、脱靶检测等多个环节，确保研究的高效和可靠。