本应用介绍了利用PG电子的µ-SlideILuer 08 通道载玻片（ibidi，货号80196）在静态条件下进行细菌生物膜的培养，以及结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与扫描电子显微镜（SEM）进行成像的实验方案。

研究选用铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa DSM50071T）接种在PG电子的µ-SlideILuer 08通道载玻片中，经过三天的培养。为了促进细胞附着和生物膜的形成，在培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞。同时，为确认生物膜的形成，向生长培养基中添加了无毒的光学示踪剂EbbaBiolight680，此试剂适合活细胞成像，并在与细胞外基质中的蛋白质和多糖结合时发出红色荧光，有助于可视化细菌生物膜。

经DAPI染色后，使用CLSM进行成像，结果显示细菌细胞主要以单层或双层结构附着。通过光学示踪剂发出的荧光信号增强，可以更清晰地识别出较厚的生物膜。该实验旨在将多种成像技术结合在同一载玻片上。在CLSM成像后，将细胞固定在载玻片上，经过脱水处理后进行干燥，准备进行SEM成像。实验室采用自制的3D模具，用于分离盖玻片，以确保操作过程中不损伤细胞的空间结构。随后，在分离出的盖玻片上，对形成的细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像。

1. 材料与试剂

• 铜绿假单胞菌培养物 Pseudomonasaeruginosa culture（DSMZ，50071）
• 胰蛋白酶胨（ThermoFisher Scientific，211705）
• 大豆蛋白胨（Millipore，107212）
• 葡萄糖（VWR，24379）
• 氯化钠（NaCl，VWR，27800）
• 磷酸氢二钾（K2HPO4, Sigma, P3786）
• 磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）
• EbbaBiolight680（EbbaBiotech AB）
• 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock conc 1 mg/mL, ThermoFisher Scientific, 62248）
• 25% 戊二醛（Sigma，G7776）
• 去离子水（diH2O）
• 无水乙醇（Sigma，34852-M）

2. 实验步骤

2.1 细菌生物膜附着

操作前请仔细阅读µ-SlideILuer 08的说明书，并遵循通用的移液和液体更换建议，确保在无菌条件下进行。实验开始前，将铜绿假单胞菌接种于LB培养基（如100 mL锥形瓶），在30°C、160转/分钟的环境下避光振荡培养过夜。根据供应商说明，将培养物以1:100比例稀释至含1:1000光学示踪剂的培养基中。

关键提示：需将所需材料（如µ-Slide）置于30°C培养箱中过夜平衡，以保证材料温度与环境一致，避免后续操作中因温差产生气泡。

1. 根据说明书，将200µL稀释菌液注入µ-SlideILuer 08通道载玻片，并用随附的盖子密封载玻片。
2. 在室温下避光静置2小时，以使细胞沉降并附着。
3. 向每个储液池加入60µL含光学示踪剂的TSB培养基，并用盖子封闭两侧储液池。
4. 将µ-Slide置于30°C避光静态条件下培养1-2天。
5. 按照说明书，从一侧储液池吸取100µL液体，加入100µL新鲜配制的含光学示踪剂的TSB培养基，完成培养基更换。
6. 重复步骤5-10次，确保培养基完全替换，避免气泡产生。
7. 向µ-Slide储液池注入60µL无细胞补充TSB培养基。
8. 再次将µ-Slide置于30°C避光静态条件下孵育1-2天，以促进进一步的贴壁及生物膜形成。

2.2 DAPI染色及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察

染色步骤直接在µ-SlideILuer 08中进行，所有操作需在通风橱内完成。

关键提示：避免一次性移除通道内所有液体，以防细胞干燥。

1. 置换为1×PBS缓冲液：从一侧储液池移除100µL培养基，向另一侧加入100µL 1×PBS冲洗液。
2. 重复步骤1（5-10次），直到培养基完全被1×PBS替代。
3. DAPI染色：将1×PBS替换为DAPI染色液，确保通道完全充满。
4. 室温避光静置孵育µ-Slide 10分钟。
5. 使用去离子水冲洗两次，以去除多余染料。
6. 最后用1×PBS冲洗一次。
7. 成像：使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）拍摄附着细胞。
8. 将µ-Slide置于4°C冷藏保存（未固定样品最长可保存2天）以待后续处理。

2.3 SEM样品制备

样品制备步骤直接在µ-SlideILuer 08中进行，所有操作应在通风橱内完成。

关键提示：请勿一次性移除通道内所有液体，以避免细胞干燥。所有清洗与溶液更换步骤均依照说明书要求执行。

1. 固定：将通道及储液池内的1×PBS替换为含25%戊二醛的1×PBS溶液，以固定贴壁细胞。
2. 室温孵育载玻片3-4小时（或4°C过夜）。
3. 用1×PBS冲洗至少5次，以彻底去除戊二醛。
4. 进行梯度脱水：依次用30%、50%、70%、90%无水乙醇孵育15分钟/次，以使附着的生物膜脱水。
5. 完全脱水：用100%乙醇处理两次，每次20分钟。
6. 干燥：将通道载玻片置于55°C培养箱中，直至液体完全蒸发（本实验干燥时间为2小时）。
7. 将µ-Slide保存于干燥器中，以待后续处理。
8. 样品切割：按示意图用手术刀或刀片切割载玻片。
9. 切割后的载玻片竖着存放在干燥器内（可保存数周）。
10. 镀金：将载玻片裁剪为约1cm小段，镀金后用于电镜观察。

综上所述，通过结合PG电子的先进技术与材料，本实验成功实现了细菌生物膜在不同显微成像技术下的观察与分析，为生物医疗研究提供了重要的实验基础和数据支持。